Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)
Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit
目錄號(hào)：K0199
保存：蛋白酶抑制劑混合物：-20℃
其它組分：2 - 8 度
組分說(shuō)明
Catalog no. K0199B
Kit Size 50 次
Nc-試劑 A 50 ml
Nc-試劑 B 3 ml
Nc-試劑 C 25 ml
蛋白酶抑制劑混合物 750 μl
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒能夠簡(jiǎn)單、快速的提取來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞及組織的細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，所提取蛋白保持生物學(xué)活性。本試劑盒首先通過(guò)細(xì)胞漿蛋白抽提試劑裂解細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞漿蛋白，然后通過(guò)離心得到細(xì)胞核沉淀。后通過(guò)細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。抽提獲得的核蛋白及漿蛋白純度高，有效避免核/漿蛋白的交叉污染，可以用于Western、Gel Shift、報(bào)告基因檢測(cè)以及酶活力測(cè)定等后續(xù)操作。
注意事項(xiàng)
1. 如需提取磷酸化蛋白請(qǐng)?jiān)诔樘嵩噭┲屑尤肓姿崦敢种苿?
2. 所有樣品操作請(qǐng)置于冰上進(jìn)行。
3. 可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整試劑用量，保證各試劑使用比例為 Nc-試劑 A：Nc-試劑 B：Nc-試劑 C=100：5.5：50。
4. 可以采用更高的速度來(lái)離心。
5. 戴手套操作。
操作步驟
l 細(xì)胞中胞漿、胞核蛋白的提取
1. 收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。
2. 請(qǐng)?jiān)诘鞍壮樘崆叭〕龀樘嵩噭㎞c-試劑A和Nc-試劑C進(jìn)行預(yù)冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μ抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。
注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。
3. 1×107細(xì)胞中加入1 ml Nc-試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物）， 渦旋5秒以充分混勻，冰上孵育20分鐘。
注意：各種細(xì)胞的特性不同，需要根據(jù)不同細(xì)胞的特性調(diào)整Nc-試劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續(xù)Nc-試劑B、Nc-試劑C的用量。
4. 加入55 μl Nc-試劑 B，渦旋5秒以充分混勻，冰上孵育1分鐘。
5. 4℃ 12,000 rpm（13,400×g）離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測(cè)（此提取液為胞漿蛋白）。
6. 向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-試劑C（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物）， 渦旋5秒以充分混勻，重懸沉淀，冰上孵育40分鐘，每隔10分鐘渦旋混勻一次，每次約15-30秒。
7. 4℃ 12,000 rpm離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測(cè)（此提取液為胞核蛋白）。 組織中胞漿、胞核蛋白的提取
1. 取材，保存組織。
2. 請(qǐng)?jiān)诘鞍壮樘崆叭〕龀樘嵩噭㎞c-試劑A和Nc-試劑C進(jìn)行預(yù)冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。
注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。
3. 稱組織重量，每100 mg組織中加入1 ml Nc-試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），用勻漿器在冰上充分勻漿，
放置在冰上孵育20分鐘。
注意：各種組織的特性不同，需要根據(jù)不同組織調(diào)整Nc-試劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續(xù)Nc-試劑B、Nc-試劑C
的用量。
4. 加入55μl Nc-試劑B，渦旋5秒以充分混勻，放置在冰上孵育 1分鐘。
5. 4℃12,000 rpm（13,400×g）離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測(cè)（此提取液為胞漿蛋白）。
6. 向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-試劑C（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物）， 渦旋5秒以充分混勻，重懸沉淀，冰上孵育40分鐘，每隔10分鐘渦旋混勻一次，每次約15-30秒。
7. 4℃12,000 rpm離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測(cè)（此提取液為胞核蛋白）。
參考附表
表1. 常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法
問(wèn)題 可能原因 解決方法
細(xì)胞未裂解 適量增加試劑的使用量
1細(xì)胞漿/核蛋白提取率低
細(xì)胞沉淀未充分懸浮 充分渦旋
未*收集細(xì)胞核 延長(zhǎng)加入Nc-試劑 B 后的離心時(shí)間
2蛋白濃度低 未加入足量抽提試劑 調(diào)整試劑使用量
3蛋白無(wú)活性或 樣本未置于4℃環(huán)境中 請(qǐng)于4℃離心，除渦旋外，保證樣品置于冰上
活性過(guò)低 蛋白酶不*抑制 添加其它蛋白酶抑制劑
未*移走細(xì)胞漿蛋白裂解液裂解細(xì)胞核前，小心移走細(xì)胞漿蛋白裂解液
4細(xì)胞核及漿蛋白
未分開(kāi) 未充分裂解細(xì)胞 增加渦旋時(shí)間確保收集的細(xì)胞充分懸浮
組織勻漿過(guò)度、不足或不均勻 優(yōu)化勻漿條件
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
